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    帶你揭開low input甲基化建庫的神秘面紗

    DNA甲基化在真核生物基因組表觀遺傳調控中起著關鍵作用,因此,5-甲基胞嘧啶(或稱甲基組)在全基因組分布一直備受關注。全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)是一種既能獲得單堿基分辨率又能獲得全基因組覆蓋的方法,已成功應用于真核系統發育樹各分支,多個物種的甲基組的分析,以及人類胚胎干細胞、誘導多能干細胞、外周血單個核細胞、結腸癌細胞等甲基組的分析中。這些WGBS數據給我們帶來了很多其他方法無法獲得的新發現,隨著測序成本的降低,WGBS越來越成為研究的首選方法。然而傳統WGBS方法對低投入量(low input)樣本來說有較大的困難,隨著甲基化應用場景的不斷增加,無論從胚胎發育的研究到腫瘤及早篩的臨床應用,低投入量樣本甲基化建庫的需求越來越多。

     

     

    說說傳統WGBS

    雖然WGBS已經被證明是強大的技術,但傳統的WGBS方法是先進行文庫構建,到連接接頭后再進行亞硫酸鹽轉化,有一些實際的局限性:

     

    首先,WGBS需要的樣本投入量比較高,WGBS的主要挑戰是在亞硫酸氫鹽轉化,亞硫酸鹽轉化過程是一個具有較大破壞性的化學轉化過程。DNA在完全轉化的條件下會發生嚴重的降解。通常,約90%投入的DNA會被降解,連接好接頭的文庫,再經過亞硫酸鹽處理,斷裂掉的分子則不能會后續擴增出來,從而損失掉。因此WGBS通常需要ug級的DNA作為起始材料。從而許多生物學上一些有意思的樣本(如早期胚胎、胚胎組織和哺乳動物的卵子以及cfDNA)的文庫制備就比較困難,甚至會失敗。那么當樣本量有限時,這種方法并不可用。

     

    此外,富含未甲基胞嘧啶的區域對鏈斷裂更敏感。經亞硫酸鹽處理后,非甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,DNA中這些轉化的區域更容易發生斷裂,斷裂后的片段因兩端不含有完整的接頭,從而不是一個有效的文庫分子,這些模板被排除掉,可能會導致不完全覆蓋和一定的偏向性。

     

    最后,對于WGBS文庫制備效率低的原因,有研究表明,亞硫酸氫鹽處理試劑盒制備的DNA質量收率并沒有那么低,從30%到70%不等。因此,WGBS文庫制備中產量低的最主要原因不是亞硫酸氫鹽處理的回收率,而是接頭連接和亞硫酸鹽處理的順序。亞硫酸氫鹽引起的DNA降解導致完整的文庫分子急劇減少,這是文庫制備效率低的主要原因。因此,為了解決這一問題,一種先轉化后建庫的方法Post-Bisulfite Adaptor Tagging (PBAT)被提出。

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    1.PBAT可以高效地制備全基因組亞硫酸氫鹽測序文庫(Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 15)

     

    隨機引物法甲基化建庫

    那么先轉化再建庫怎么實現呢?由于亞硫酸鹽處理的DNA是單鏈的,PBAT的實現需要一種有效的方法將接頭序列連接到單鏈DNA (ssDNA)上。研究者們需要在單鏈DNA上做研究,一種通過兩輪隨機引物擴增,被稱為隨機啟動介導的PBAT,即random priming-mediated PBAT (rPBAT)的方法被開發出來。圖2所示經過亞硫酸鹽處理后的樣本通過兩輪隨機引物擴增,連接上完整的接頭,即為完整的文庫。

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    2.隨機引物介導的PBAT方法(Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17)

     

    隨機啟動介導的PBAT使得甲基化文庫構建的效率大大提高,甚至可能從125 pg基因組DNA中制備WGBS文庫。通過不斷地優化,rPBAT甚至被用于單細胞甲基組測序,盡管基因組覆蓋率有所降低。事實上,rPBAT文庫,特別是那些從極少量DNA (250 pg)中制備的文庫,包含越來越多的不能Mapping的reads,已經表明,rPBAT文庫包含相當大比例的嵌合讀長。rPBAT的這些缺點可能歸因于隨機引物啟動反應。

     

    首先,隨機啟動通常不是從3'端開始,而是從目標ssDNA片段內的一個位點開始,從而留下一個邊緣序列,該邊緣序列不包括在新合成的待測序的reads中。因此,每個庫片段不可避免地比它的目標ssDNA短,特別是當使用兩輪隨機引物反應時。第二,隨機引物的效率取決于隨機引物-基因組DNA雙鏈的穩定性。因此,隨機啟動反應通常會導致對GC豐富區域的偏好,而對AT豐富區域的基因組覆蓋效率較低。第三,隨機引物不僅發生在引物和基因組DNA之間,也發生在兩個引物之間,以及兩個基因組DNA片段之間,從而分別產生不可Mapping和嵌合的reads。

     

    因此,為了解決這個問題,可以通過消除任意一個或兩個隨機引物擴增的步驟,來延長庫片段的長度、減少GC偏向覆蓋、減少不可Mapping和嵌合率來進一步改善rPBAT。

     

    Tdt輔助連接甲基化建庫法

    雖然rPBAT制備文庫的效率要遠遠高于傳統WGBS方法,但rPBAT仍僅將約10%的投入DNA轉化為文庫片段,仍有進一步改進的空間。那么有沒有能減少隨機引物擴增步驟的方法呢?研究者發現有兩種可以替代隨機引物擴增法進行接頭連接。一種是使用RNA連接酶,它可以將5'端磷酸化的接頭連接到3'末端。但是RNA連接酶對DNA oligo之間的連接效率要遠低于RNA之間的連接。另外一種方法是通過末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)介導的末端加尾法連接到ssDNA的3'端,末端序列可做為引物,合成ssDNA的互補鏈。有研究者將兩種方法組合了一種叫Tdt輔助連接的PBAT (tPBAT)的方法,該方法也成功的從125 pg的人類基因組DNA中制備了tPBAT文庫。

     

    前面提到,由于隨機引物很少與目標ssDNA的3'端雜交,不易覆蓋亞硫酸鹽轉化DNA片段全長的DNA。而且,兩輪隨機引物擴增使得到的DNA片段短得多。tPBAT法通過Tdt連接取代了傳統rPBAT方法中的第二個隨機引物步驟,產生了更多插入片段更長的文庫分子。圖3結果表明tPBAT法確實能夠解決原來rPBAT法插入片段短的問題。
     

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    3.兩種PBAT方法mapping 到基因組上reads長度分布(Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 15)

     

    對于tPBAT不同投入量的研究表明(圖4),其具有和rPBAT幾乎相同的靈敏性,即均能對低投入量樣本進行甲基化建庫。但當投入DNA的起始量小于1ng時,rPBAT文庫的分子產量超過了tPBAT文庫的分子產量(圖4)。不過,投入和產出呈近似線性關系。表1中測序結果發現tPBAT文庫產量在低投入量時要低,但mapping率要遠高于rPBAT法。隨著投入DNA的減少,rPBAT和tPBAT文庫的Mapping率分別下降。分析其原因,tPBAT和rPBAT的凈產出上在很大程度上是可比較的,因為tPBAT在庫片段長度上優于rPBAT,另外嵌合體也會占據一定比例的文庫產量。

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    4.tPBAT和rPBAT法DNA投入量和文產出的關系(Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 15)

     

    1.tPBAT和rPBAT的文庫收率和reads Mapping率對比(Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 15

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    除了上述的方法之外,還有一些更簡單高效的針對亞硫酸鹽處理的甲基化文庫構建方法,應用于少量或者降解樣本。隨著技術的發展,更有效、更少偏差和更長片段的WGBS文庫構建方法將不斷涌現出來,對于低投入量的PBAT法也加速WGBS的應用,得以在各種有限制的樣品中使用,甚至包括博物館樣品和瀕危物種的組織,這些物種的DNA通常嚴重降解甚至變性或者樣本量比較少。

     

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    參考文獻

    [1] Miura F, Enomoto Y, Dairiki R, Ito T.Amplification-free whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Res. 2012 Sep 1;40(17):e136.
    [2] Khanna, A., Czyz, A. & Syed, F. EpiGnome? Methyl-Seq Kit: a novel post–bisulfte conversion library prep method for methylation analysis. Nature Methods
    [3] Miura F, Shibata Y, Miura M, Sangatsuda Y, Hisano O, Araki H, Ito T.Highly efficient single-stranded DNA ligation technique improves low-input whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Res. 2019 Sep 5;47(15):e85.
    [4] Miura,F. and Ito,T. (2015) Highly sensitive targeted methylome sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. DNA Res., 22, 13–18

     


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